紫杉醇誘導絨癌JAR細胞的凋亡

  紫杉醇誘導絨癌jar細胞的凋亡

  中華婦產科雜誌 1999年第2期第0卷 論著摘要

  作者:陳懷增 石一復 鄭偉

  單位:300006 杭州,浙江醫科大學附屬婦產科醫院

  紫杉醇對晚期卵巢癌及轉移性乳腺癌、肺癌具有明顯療效。紫杉醇具有獨特的抗腫瘤機理,其誘導細胞調亡僅在白血病、卵巢癌及乳腺癌的體外實驗中有所報道[1-3]。本研究旨在闡明紫杉醇誘導絨癌細胞調亡的生化、形態學以及細胞週期的改變,以探討其發生機理。

  一、材料和方法

  1.細胞株及細胞培養: 人絨癌jar細胞株由中國科學院上海細胞所細胞庫提供,含10%胎牛血清的rpmi-1640培養基,於5%co2,37℃孵箱內孵育。

  2.dna瓊脂凝膠電泳: 紫杉醇(北京協和藥廠生產)分為1、3、10、30 、100nmol/l 5種濃度。生理鹽水作為對照。作用24小時後收集細胞,蛋白酶裂解,酚-***純化,1.5% 瓊脂電泳,成像儀攝片並記錄。

  3.核酸染色(feulgen反應): 紫杉醇藥物處理jar 細胞24小時後,用組織化學方法對核酸進行染色[4]。

  4.電鏡觀察調亡小體: 設對照及30nmol/l濃度各1例,常規超薄切片,鈾鉛染色後電鏡觀察。

  5.測定細胞週期分佈:設紫杉醇10、30、100nmol/l及對照,12小時、48小時兩種時間,經facs型流式細胞儀測定細胞週期分佈百分率。

  二、結果

  1.jar細胞dna的斷裂情況: 30nmol/l以上濃度的紫杉醇與jar細胞作用24小時後,可見典型的“階梯狀”dna斷裂條帶,條帶密度隨紫杉醇濃度升高而增高。另一方面,100nmol/l紫杉醇與jar細胞作用18小時後,也出現dna斷裂條帶。

  2.jar細胞核酸形態的改變: 對照細胞核大,染色均勻,核邊界清楚。隨著紫杉醇濃度的升高,細胞染色質濃集,細胞變小,低濃度時可清晰分辨染色體,而高濃度時染色體濃整合點狀。

  3.凋亡小體:電鏡下觀察, 對照細胞核呈圓形、規則,染色質分佈均勻,可見1~2個核仁。紫杉醇作用24小時,部分細胞核染色質濃集,緊靠核膜,核膜內陷,不規則。細胞外可見凋亡小體,內有濃集染色質,胞漿物質濃縮(圖1,2)。

  圖1 對照細胞核成圓形、規則,染色質分佈均勻,可見1~2個核仁。 ×12 000

  圖2 紫杉醇(30 nmol/l)作用24小時後,細胞染色質濃集,不規則,可見凋亡小體。×7 100

  4.細胞週期分佈:10、30、100nmol/l濃度紫杉醇與jar細胞作用12小時及24小時後,g2/m 期百分率隨濃度增高而遞增,g2/m期和s期比值也呈遞增關係。隨時間延長,比值升高更為明顯(見表1)。

  表1 紫杉醇與jar細胞作用後細胞週期分佈(%)

  作用時間

  g1期s期g2/m期g2/s期

  12小時

  對照

  38.0

  59.9

  2.1

  0.035

  紫杉醇

  10nmol/l34.927.337.71.383

  30nmol/l19.575.05.50.073*

  100nmol/l15.624.959.42.386

  24小時

  對照32.064.63.50.054

  紫杉醇

  10nmol/l37.95210.00.192

  30nmol/l60.24.235.68.476

  100nmol/l54.47.438.25.162

  *為實驗誤差

  三、討論

  本研究應用dna 瓊脂凝膠電泳,發現紫杉醇與jar細胞作用後,出現典型的dna斷裂條帶,且條帶密度和紫杉醇作用時間及濃度呈依賴關係。應用核酸染色及電鏡觀察,出現明顯的凋亡小體,細胞形態與文獻報道相同,提示紫杉醇誘導jar細胞死亡是一個凋亡過程。

  bhalla等[1]的研究發現,紫杉醇誘導早粒細胞性白血病細胞(hl-60)凋亡發生在分裂期阻滯之後。donaldson等[5]也發現,紫杉醇對細胞週期同步在g0/g1期和g2/m期的細胞,均能在20小時內誘導細胞凋亡,而且g0/g1期細胞和g2/m 期細胞一樣,也經歷了分裂期阻滯,提示紫杉醇誘發的細胞分裂期阻滯是凋亡發生的重要前提。本研究發現,絨癌jar細胞在紫杉醇作用12小時後明顯被阻滯在g2/m期,而此時細胞尚未崩解成凋亡小體,提示由於紫杉醇的作用,細胞 dna 受到損害,細胞阻滯在分裂期,但損害不能被內在機制修復,從而啟用促細胞凋亡的因子,使細胞發生凋亡。

  絨癌是當前對化療最敏感的惡性腫瘤之一。近年來,雖然治癒率不斷提高,但對耐藥患者仍無有效藥物。紫杉醇具有和以往藥物不同的獨特作用機理,提示可用於對絨癌耐藥患者的治療。

  參考文獻

  1 bhalla k, huang y, tang c, et al. taxol induces internucleosomal dna fragmentation associated with programmed cell death in human myeloid leukemia cell. leukemia, 1993, 7: 563-575.

  2 willingham m, bhalla k. transient mitotic phase localization of bcl-2 oncoprotein in human carcinoma cells and its possible role in prevention of apoptosis. j histochem cytochem, 1994, 42: 441-450.

  3 陳麗榮,鄭樹,willingham mc, et al. 紫杉醇誘發人乳癌細胞凋亡的機制研究. 中華腫瘤雜誌,1997,19:103-105.

  4 陳嘯梅,周文鬱,彭俊雲主編.組織化學手冊.北京:人民衛生出版社,1982.47-48.

  5 donaldson kl, godlsby g, kiener da, et al. activation of p34 cdc2 coincident with taxol-induced apoptosis. cell growth differ, 1994, 5: 1041-1050.

  (收稿:1998-02-26  修回:1998-11-19)

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