川崎病患者外周血淋巴細胞凋亡減少的初探

　　川崎病患者外周血淋巴細胞凋亡減少的初探

　　中國免疫學雜誌 1999年第2期第15卷 臨床免疫學

　　作者：易豈建　李成榮　楊錫強　劉恩梅

　　單位：重慶醫科大學兒童醫院，重慶400014

　　關鍵詞：川崎病；細胞凋亡；il-6

　　中國圖書分類號　r593.2

　　摘　要　目的：探討川崎病(kd)的免疫發病機理。方法：對26例kd患者和20名正常兒童外周血單個核細胞(pbmc)經anti-cd3誘導體外培養不同時間的凋亡進行計數凋亡細胞百分率和片段dna分析。結果：kd患者凋亡細胞百分率和片段dna出現時間較正常對照降低(p＜0.001)和延遲，pbmc體外培養產生il-6水平較正常對照顯著升高(p＜0.001)；加抗il-6單抗培養或靜脈注射免疫球蛋白(ivig)治療可顯著降低il-6水平，逆轉凋亡細胞百分率的降低和dna片段化延遲。結論：kd患者pbmc凋亡下調可能與本病il-6水平異常增高有關。

　　preliminary study on the decreased apoptosis of lymphocytes in acute kawasaki disease

　　yi qi-jian,li cheng-rong, yang xi-qiang et al.

　　children's hospital chongqing university of medical sciences,chongqing

　　400014

　　abstract　objective:to further explore the pathogenesis of kawasaki disease (kd).methods:calculating percentage of apoptotic cells and assaying dna fragmentation in peripheral blood mononuclear cell(pbmc)stimulated by anti-cd3 for 0，12，24，48，72 h in vitro from 30 patients with kd and 20 age-matched health children.results:apoptotic cell percentage and dna fragmentation were markedly decreased(p＜0.001) and delayed (compared with those in normal controls),which could reach the states of control group only by 72 h cultured.remarkabely increased production of il-6 in cultured supernatants of pbmc induced by phytohemagglutinin(pha) from kd patients was found in comparison with those of pbmc from controls(p＜0.001).adding anti-il-6 mab to the cultures or using intravenous immunoglobulin(ivig)in vivo led to significantly decreased production of il-6(p＜0.001),and reversed decreased apoptotic cell percentage and delayed dna fragmentation to be compatible with normal controls.conclusion:over-produced il-6 might be involved in down-regulation of peripheral blood lymphocyte apoptosis in kd.

　　key words　kawasaki disease　apoptosis　il-6

　　細胞凋亡(apoptosis)是細胞生理性死亡的主要形式［1］。機體細胞增殖和死亡過程達到動態平衡是維持其自身恆定的必要條件。細胞凋亡過度或不足都會引起細胞數量失衡，導致臨床疾病［2］。已推測凋亡可能與系統性紅斑狼瘡(sle)等自身免疫性疾病有關。川崎病(kawasaki disease,kd)是一原因不明的急性血管炎，其發病可能為感染或其他因素觸發的異常免疫反應。本文擬對kd患者外周血單個核細胞(pbmc)體外培養時的凋亡進行觀察，並對有關因素進行探討。

　　1　材料與方法

　　1.1　研究物件　收集26例住院kd患者，均符合日本mcls研究會診斷標準［3］，隨機分為兩組，阿司匹林(asp)治療組和ivig治療組(ivig+asp)。ivig組16例，男11例，女5例，年齡8.0個月～6.5歲(平均2.8±1.3歲)，常規asp治療組10例，男6例，女4例，年齡6.5個月～5.5歲(平均2.5±1.2歲)，兩組患者開始治療時病程長短、病情輕重均無明顯差異。健康對照組20例，男12例，女8例，年齡1.0歲～6.2歲(平均2.6±1.2歲)。

　　1.2　治療方法　患者住院時病程為5.0～7.0 d，入院時立即給予治療。ivig組於平均病程5.8 d，使用ivig治療(2 g/kg,長春生物製品研究所，批號91-13)，同時聯合應用asp 50 mg/(kg。d)，退熱後減至10 mg/(kg。d)。asp組於平均病程6.2 d開始給予asp治療，劑量同前。

　　1.3　細胞分離及培養　兩組患兒均在用藥前和用藥後3.0～5.0 d取肝素抗凝血，常規分離pbmc，調細胞濃度至1×106 ml-1，置24孔培養板，加anti-cd3(終濃度100 μg/ml)，部分加抗il-6單抗(第四軍醫大學免疫學教研室，終濃度1∶1 000)，於37℃，5% co2孵箱分別培養0、12、24、48、72 h。

　　1.4　凋亡細胞形態學觀察　按照文獻［4］方法，在熒光顯微鏡下觀察，細胞體積縮小，核固縮，染色質凝固，沿核膜呈點狀、新月形、桿狀等定為凋亡細胞，計算200個細胞及凋亡細胞百分率。

　　1.5　dna梯度觀察　根據文獻［5］方法略加改良，1×106 ml-1培養細胞中加入低滲性緩衝液(10 mmol/l tris,1 mmol/l edta,0.2% tritonx-100,sigma公司)0.5 ml溶解細胞，離心取上清，用飽和酚(ph＞7.8)及***、異戊醇(24∶1)抽提，加無水乙醇，-20℃過夜。70%乙醇洗滌後，rnasea(20 μg/ml，北京華美公司)去除rna，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈透照下觀察片段dna梯度，並照相記錄。

　　1.6　il-6的測定　無菌收集各種條件下pbmc經pha(終濃度為20 μg/ml)刺激48 h後培養上清，採用雙抗體夾心elisa法檢測。il-6試劑盒為第四軍醫大學免疫學教研室產品。

　　2　結果

　　2.1　凋亡細胞百分率　正常對照組pbmc體外培養不同時間後可見細胞核固縮，呈新月形、桿狀等凋亡典型的形態學改變，kd患者出現細胞形態學改變明顯延遲。其中培養24、48 h後，kd患者pbmc凋亡百分率與正常對照組相比，結果見表1。

　　經ivig治療後，kd患者pbmc體外培養凋亡細胞百分率明顯提高，治療前後差異顯著；asp組治療前後無差別 ，兩組治療後比較有顯著差異，見表2。

　　表1　kd與正常兒童pbmc的apo發生率比較(±s，%)

　　tab.1　percentage of apoptotic cell of pbmc from kd patients and normal subjects(±s，%)

　　groupsn0 h24 h48 h72 h

　　normal202.01±1.2121.48±3.4131.48±4.4640.74±5.87

　　kd302.26±1.071)10.89±3.612)18.67±5.6833.15±8.45

　　note:compared with normal 1)p＞0.05，2)p＜0.001

　　表2　治療前後kd患兒pbmc的apo發生率比較(±s，%)

　　tab.2　percentage of apoptotic cell of pbmc from kd patients before and after different treatment(±s，%)

　　groups0 h24 h48 h72 h

　　beforeafterbeforeafterbeforeafterbeforeafter

　　ivig+asp

　　(n=16)

　　0012.57±3.721)22.33±6.673)20.00±4.121)32.27±6.033)34.57±7.321)42.08±5.284)

　　asp alone

　　(n=10)

　　0011.79±4.392)13.48±3.9819.28±4.482)24.54±6.3535.29±6.102)38.58±5.47

　　note:compared with after treatment 1)p＜0.05，2)p＞0.05；compared with after asp alone treatment，3)p＜0.05，4)p＞0.05

　　圖1　不同條件dna梯度

　　fig.1　dna ladder by 1% agarose gel electrophoresis in different conditions

　　note:1.ecori/hind marker；2,3,4,5,6,7.pbmc from normal subject cultured for 0,12,24,48,72,96 h,respectively;8,9,10.pbmc from kd patient after ivig cultured for 24,48,72 h,respectively;11.pbmc from kd cultured with anti-il-6 for 48 h;16,15,14,13,12.pbmc from kd patient cultured for 0,12,24,48,72 h,respectively

　　當kd患者pbmc加入抗il-6單抗培養，凋亡發生率(24、48 h 分別為20.83±7.98，29.33±8.19)顯著增高，與未加抗il-6單抗組比較(24、48 h 分別為11.52±6.86，19.10±6.07)，差異顯著(p＜0.02，＜0.01)。

　　2.2　片段dna梯度　正常對照組pbmc經anti-cd3刺激培養24 h可見dna片段化傾向，並隨時間延長而明顯，kd患者pbmc需培養72 h才有微量dna片段。當ivig治療後及加入抗il-6單抗培養時，dna梯度出現時間明顯提前，見圖1。

　　2.3　il-6水平測定　kd患者pbmc體外培養產生il-6水平較正常對照組明顯增高(t＝6.885，p＜0.001)，當ivig治療後，il-6水平降低，治療前後差異顯著(t＝5.587，p＜0.001)；asp治療組治療前後il-6水平無差別(t＝1.515，p＜0.05)；kd患者pbmc加入抗il-6單抗培養，其上清il-6水平顯著降低，與未加抗il-6單抗組比較，差異顯著(t＝6.334，p＜0.001，見圖2)。

　　圖2　不同組別il-6水平

　　fig.2　il-6 level in pbmc supernatant of various groups

　　3　討論

　　細胞凋亡與細胞的增殖、分化一樣，屬於最基本的細胞生物學行為，受到細胞內外多種因素的調節，在機體的發育與自身穩定中起重要作用［6］。凋亡異常與多種疾病密切相關，凋亡過多可引起免疫缺陷病和艾滋病，神經退行性變等，凋亡過少則與腫瘤等有關。近年提出凋亡被異常抑制可能與某些自身免疫性疾病有關［7］。

　　本研究以正常兒童pbmc為對照，探討kd患者pbmc體外培養是否存在細胞凋亡常。wesselborg和reed實驗發現，pbmc培養時加入pha、anti-cd3(okt3)或anti-tcr(bmao31)單抗時，48 h開始出現凋亡的細胞形態學和dna電泳改變［8，9］。本實驗正常對照組pbmc體外培養結果與此相符。而kd患者pbmc體外培養時凋亡明顯延遲，72 h凋亡細胞百分率和dna片段化才接近正常24 h水平。表明活化的細胞克隆持續存活，免疫耐受遭到破壞。本文結果提示kd的發病除與t細胞的異常增殖活化和b細胞多克隆活化有關外，可能還與外周血淋巴細胞凋亡延遲有關。

　　本文及文獻報道kd患者血清及pbmc體外培養il-6水平異常增高。il-6可抑制野生型p53表達和p53誘導的骨髓白血病細胞的凋亡［10］，劉佳等報道il-6抑制小鼠(b雜交瘤)7td1 細胞凋亡［11］。本研究透過體內ivig治療及體外pbmc培養加入抗il-6單抗時，il-6水平明顯降低，凋亡細胞百分率增高及片段dna梯度出現時間提前，提示kd患者pbmc發生凋亡降低或延遲可能與本病異常升高的il-6有關。其機理尚待進一步研究。

　　作者簡介：易豈建，男，31歲，博士，主治醫師，主要從事小兒心臟免疫研究；

　　李成榮，男，45歲，教授，碩士生導師，主要從事分子生物學和腎臟免疫學研究

　　4　參考文獻

　　1　kerr j f， wyllie a h,carrie a r. apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.br j cancer,1972;26:239

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　　11　劉　佳，李　宏，hamou m f et al. il-6對小鼠(b雜交瘤)7td1細胞凋亡的調控作用.中華微生物學和免疫學雜誌，1995；15(6)：382

　　〔收稿1997-02-07　修回1997-12-29〕