實驗性過敏性腦脊髓炎豚鼠中樞神經系統一氧化氮合酶的表達

　　實驗性過敏性腦脊髓炎豚鼠中樞神經系統一氧化氮合酶的表達

　　中華神經科雜誌 1998年第3期第31卷 *論著*

　　作者：於國平　朱克　于濤　田東華　周湘軍

　　單位：100853 北京，解放軍總醫院神經內科(於國平、朱克、田東華、周湘軍)；黑龍江省齊齊哈爾市第一人民醫院神經內科(于濤)

　　關鍵詞： 腦脊髓炎；氧合酶類；一氧化氮

　　【摘要】　目的　探討誘導型一氧化氮合酶(inos)在中樞神經系統脫髓鞘疾病中的作用。方法　採用硫辛胺脫氫酶染色和抗誘導型一氧化氮合酶(抗inos)抗體的免疫組化方法，對髓鞘鹼性蛋白誘導豚鼠產生的實驗性過敏性腦脊髓炎(eae)病程中，腦和脊髓的一氧化氮合酶(nos)和inos表達情況進行研究。結果　在eae的急性期主要為血管、血管周圍細胞、浸潤細胞和小膠質細胞顯示inos免疫反應陽性，在恢復期星形細胞則出現免疫反應陽性。結論　提示一氧化氮是eae早期血腦屏障破壞以及進展期髓鞘和少突膠質細胞破壞的重要介導物質。

　　expression of inducible nitric oxide synthase in the central nervous system of guinea pigs with experimental allergic encephalomyelitis　yu guoping*, zhu ke, yu tao, et al. *department of neurology, general hospital of pla, beijing 100853

　　【abstract】　objective　to investigate the role of inducible nitric oxide synthase (inos) in demyelination of the central nervous system.methods　the experimental allergic encephalomyelitis (eae) was induced in guinea pigs (n=64) and the expression of inos in the central nervous system was examined using monoclonal antibody to inos by immunohistochemistry and nadph diaphorase histochemistry in various stages of eae.results　the results indicated that in the acute stage of eae, the macrophages invaded the brain, especially in the white matter, and the microglia began to become reactive with the irregular morphological changes. both of the two kinds of cells expressed inos in the early stage of eae and the expression of inos increased obviously at the peak stage of eae. in the recovery stage, the reactive astrocytes surrounding the lesion also expressed inos.conclusions　the nitric oxide produced by the glial cells might play a key role in the process of eae in regard to the destruction of the blood-brain-barrier in the early stage and the myelin and the oligodendroglia in progressing stage.

　　【key words】　encephalomyelitis 　　oxygenases　　nitric oxide

　　90年代以來，國外部分學者開始研究一氧化氮(nitric oxide, no)在中樞神經系統炎性脫髓鞘病中的變化，並認為no可能在發病過程中發揮一定的作用［1，2］。我們採用硫辛胺脫氫酶染色(nadph-d)法和免疫組織化學方法，對實驗性過敏性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, eae)豚鼠腦和脊髓中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, nos)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, inos)表達的程度、組織細胞型別和不同發病時期的變化進行觀察，以探討no對中樞神經免疫性疾病的影響，從而為臨床治療提供幫助。

　　材料和方法

　　一、材料

　　雌性hartley豚鼠64只(二級，購於中國醫學科學院動物中心)，6周齡，體重180～230 g。隨機分為兩部分，每部分32只，分別進行nadph-d酶組化染色和抗inos免疫組化染色。每部分分實驗組24只，對照組8只；實驗組每隻動物於左後足底皮下注射完全福氏佐劑50 μl加牛脊髓鹼性髓鞘蛋白(mbp)50 μl(含mbp 100 μg)。實驗組又隨機分為4組，每組6只，分為發病前3天組、發病初期組、高峰期組和恢復期組；根據mbp誘發豚鼠eae的平均潛伏期，取腦和脊髓，觀察時間分別為免疫後5天(平均發病前3天)、發病後24小時、5天和14天。對照組每隻注射完全福氏佐劑50 μl加生理鹽水50 μl。取腦和脊髓，觀察時間同實驗組，每個時間點觀察2只。

　　二、方法

　　1.eae腦和脊髓的nadph-d法酶組化研究：動物採用10%的水合氯醛(350 mg/kg體重)麻醉後，立即暴露心臟，經左心室插管至升主動脈，快速灌注肝素化生理鹽水150 ml，隨後灌注4%的冷多聚甲醛(0.1 mol/l pb)約500 ml，灌注完畢後，立即取腦和脊髓置20%蔗糖(0.1 mol/l pb)中儲存。

　　nadph-d染色方法：標本在leica切片機上行連續冰凍切片，片厚20 μm，每10張留取1張掛於載玻片上(玻片採用apes處理)；晾乾後入0.01 mol/l的pbs(ph值7.4)中浸泡5分鐘後，加入孵育液，37℃孵育30分鐘。孵育液用0.2% triton x-100(0.01 mol/l pbs, ph值7.4)加入1 g/l nadph(sigma)、0.1 g/l nbt(sigma)配製。染色完成後入0.01 mol/l pbs洗淨，梯度酒精脫水，二甲苯透明，dpx封片觀察。空白對照未加nadph，餘步驟同上。

　　2.eae腦和脊髓inos免疫組化研究：取標本時除灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/l pb)800 ml，灌注時間約1小時外，餘同nadph-d染色取標本方法。採用抗鼠inos多克隆抗體［nos2(m19)，santa cruz］，識別小鼠inos的1 126～1 144氨基酸序列，抗體稀釋度為1∶100。小膠質細胞識別採用抗蓖麻凝集素rca-1(vector)，抗體稀釋度1∶300；星形膠質細胞的識別採用抗膠質纖維酸性蛋白(gfap)多克隆抗體(dako)，抗體稀釋度1∶75。

　　染色方法：全腦及脊髓標本採用冷凍切片機切片，厚度50 μm，每隔250 μm切片1張。採用免疫組化abc漂染法染色，用ni-dab-葡萄糖氧化酶顯色系統顯色；用1%的明膠貼片，晾乾後梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察。

　　結果

　　發病初期組、高峰期組和恢復期組動物臨床均有發病，每組發病3～5只不等，對照組動物未見異常。

　　一、nadph-d法酶組化染色

　　對照組腦和脊髓中部分神經元顯示nadph-d陽性，大部分血管未見nadph-d染色，少數血管可見個別細胞呈現nadph-d陽性，推測陽性細胞為血管內皮細胞。而在eae發病前3天，胸、腰段脊髓白質中的部分血管、血管周圍浸潤細胞及開始活化的小膠質細胞(與抗rca-1陽性細胞相似)呈現nadph-d陽性(圖1)，這種nadph-d陽性的血管分佈與發病初期注射辣根過氧化物酶後顯示病灶的分佈相似，說明臨床症狀出現前，潛在病灶中血管內皮細胞及血管周圍細胞表達nos增加；在eae發病初期，除脊髓血管及血管周圍細胞nadph-d染色較前明顯增加外(圖2)，小腦、腦幹和側腦室周圍白質亦出現上述改變；在eae高峰期，除發病初期的改變外，病灶周圍的星形膠質細胞(類似gfap陽性細胞)出現nadph-d陽性(圖3)，而這種nadph-d陽性星形膠質細胞在總的活化星形膠質細胞(gfap陽性)中所佔比例很小。在eae恢復後期，主要為星形膠質細胞呈現nadph-d陽性，部分血管周圍可見大量的星形膠質細胞(圖4)。

　　二、抗inos的免疫組化染色

　　對照組腦和脊髓未見inos陽性細胞，血管亦未見染色。發病前3天組抗inos免疫組化結果同對照組；eae發病初期，胸、腰段脊髓病灶中的血管、血管周圍浸潤細胞以及部分腦膜浸潤細胞出現inos陽性(圖5)，血管周圍細胞亦有inos陽性小膠質細胞(形態與抗rca-1陽性細胞相似)出現(圖6)；發病高峰期除可見到發病初期的改變外，還可見到血管附近有散在inos陽性的星形膠質細胞(形態與抗gfap陽性細胞相似，圖7)。在eae的恢復期，血管及血管周圍細胞表達inos的量明顯減少(圖8)。

　　討論

　　本研究中所採用的多聚甲醛固定組織切片中，不溶於水的甲潛(formazan)可以被具有硫辛氨脫氫酶活性的酶所沉澱，使四唑(tetrazolium)變成藍黑色，與nos有關的黃素部分可以催化nadph-d的活性。除nos以外的其他幾種可以催化nadph-d活性的酶，由於多聚甲醛的固定而失活。所以，中樞神經系統的nadph-d酶組織化學染色被認為是nos活性的標誌［3，4］。

　　在對照組中樞神經組織nadph-d染色時，僅有結構型nos顯色，即部分神經元和少量血管內皮細胞，如實驗組中其他細胞顯示nadph-d陽性，則為病理狀態。

　　本組nadph-d酶組織化學染色和抗inos抗體免疫組織化學染色結果均顯示，在eae臨床症狀出現前，病灶中的血管周圍細胞、浸潤細胞以及小膠質細胞出現inos陽性；在發病初期，除上述改變明顯外，inos陽性的小膠質細胞明顯增多，而在高峰期和恢復期，血管周圍的星形膠質細胞出現inos陽性，這與okuda等［2］報道的僅浸潤的巨噬細胞呈現inos陽性的結果不同。本研究結果顯示，eae病灶中的血管周圍細胞(包括浸潤細胞)、小膠質細胞以及星形膠質細胞均表達inos，只是eae的不同臨床時期所表達inos的細胞型不同。以上這些改變可能與eae的發病機制有關。

　　1.inos產生的機制：eae病灶中inos的產生主要與某些致炎性細胞因子的誘導有關。在離體條件下，脂多糖(lps)可以誘導nos的產生，當lps與干擾素-γ(ifn-γ)、白細胞介素-1(il-1)和腫瘤壞死因子-α(tnf-α)等細胞因子共同刺激時，這種誘導作用明顯加強［5，6］。eae最早期的改變之一就是血腦屏障的通透性異常增加，並伴有免疫細胞在血管周圍形成“袖套”樣改變以及向組織中浸潤，在這過程中，血清中的細胞因子或浸潤的炎細胞釋放的細胞因子，如ifn-γ、il-1和tnf-α可以誘導血管周圍細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞產生nos。另外，活化的小膠質細胞在eae病程中也可產生這些細胞因子。

　　2.inos在eae中的作用：no引起eae的中樞神經系統損害機制目前還不完全清楚，可能透過以下途徑引起髓鞘和少突膠質細胞的損害：(1)no可催化fe-s依賴性酶而介導少突膠質細胞的死亡，而且可能防止受損的髓鞘再建；(2)巨噬細胞釋放的超氧化陰離子與no反應生成過硝酸鹽(peroxynitrite)，過硝酸鹽和它的裂解產物與脂質反應導致髓鞘的破壞；(3)透過啟用胞漿中的鳥苷酸環化酶，而使細胞內的cgmp水平升高。cgmp的聚集能增加少突膠質細胞和髓鞘對tnf-α的敏感性，進而造成少突膠質細胞和髓鞘的破壞［7］。

　　本研究結果顯示，在eae臨床症狀出現前，脊髓白質中部分血管和血管周圍細胞呈現inos免疫反應陽性，可能與eae的血腦屏障改變有關。眾所周知，腦組織中的血管內皮細胞在許多方面與周圍的不同，它們之間緊密連線，無微孔並缺乏囊泡。在eae時，由於血管及血管周圍細胞(包括星形膠質細胞)表達的inos增加，即no的產生增加，透過增加對tnf-α細胞毒性的敏感性以及no和no產物本身的影響，進而造成血管內皮細胞和星形膠質細胞的破壞。作為這兩種細胞破壞的結果，血腦屏障發生變化，使它的通透性明顯增加。目前認為，血腦屏障的破壞是eae發病的最早期改變之一［8］，因此推測，no產生增加可能是eae發病的重要環節之一，給予inos抑制劑，可能有助於eae的恢復。

　　no作為eae活化的小膠質細胞產物之一，一方面參與了小膠質細胞對周圍組織的破壞，另一方面可能加速了小膠質細胞本身的死亡。星形膠質細胞表達inos的作用機制目前還不清楚。體外研究結果顯示，星形膠質細胞在有inf-γ存在時，也能發揮抗原呈遞細胞的功能［9］，即星形膠質細胞在一定條件下，不同程度地扮演了免疫效應細胞的角色。星形膠質細胞中產生的no可能與其發揮免疫效應有關。

　　圖1　症狀出現前3天，腰段脊髓白質部分小血管、血管周圍浸潤細胞和小膠質細胞樣細胞(↑)呈現陽性，nadph-d染色　×300　　圖2　症狀出現時，胸段脊髓白質陽性細胞明顯增多，nadph-d染色　×180　　圖3　症狀高峰期，胸段脊髓白質部分星形膠質細胞樣細胞呈現陽性，nadph-d染色　×180　　圖4　症狀恢復期，胸段脊髓白質主要為血管及周圍星形膠質細胞樣細胞呈現陽性，nadph-d染色　×300　　圖5　症狀出現時，腰段脊髓白質縱切，血管和周圍細胞呈現陽性，抗inos免疫組化染色　×150　　圖6　症狀出現時，腰段脊髓白質橫切，陽性細胞主要為小膠質細胞樣細胞，抗inos免疫組化染色　×300　　圖7　症狀高峰期，胸段脊髓白質縱切，血管及周圍細胞呈現明顯陽性，抗inos免疫組化染色　×300　　圖8　症狀恢復期，胸段脊髓白質星形膠質細胞樣細胞呈現陽性(↑)，抗inos免疫組化染色　×300

　　脂質沉積性肌病的臨床和病理特點

　　參考文獻

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　　8　moor ac, de vries he, de boer ag, et al. the blood-brain barrier and multiple sclerosis. biochem pharmacol, 1994, 47:1717-1724.

　　9　fontana a, fierz w, wekerle h. astrocytes present myelin basic protein to encephalitogentic t- cell lines.nature, 1984, 307:273-276

　　(收稿：1997-03-17　　修回：1998-04-28)