重症肌無力特異性細胞免疫應答

重症肌無力特異性細胞免疫應答

免疫學雜誌 2000年第2期第16卷 中國免疫學會首屆青年學術會議優秀論文選登

作者：國 紅　孫 宏　許賢豪　王 紅　張 華　李寶林

單位：衛生部北京醫院神經科，北京 100730

關鍵詞：重症肌無力；干擾素-γ；白細胞介素-4

摘　要：目的瞭解重症肌無力(mg)特異性細胞免疫應答情況。方法採用酶鏈免疫吸附試驗(elisa)和逆轉錄-聚合酶鏈反應(rt-pcr)結合狹縫印跡雜交檢測mg患者及健康對照者的pbmc和胸腺細胞achr刺激後ifnγ和il4的表達及轉錄，並對行胸腺摘除(tx)者進行了隨訪。結果總mg患者組pbmc ifn-γ表達高於對照,尤以急性mg更著。增生的胸腺細胞ifn-γ、il―4轉錄和il-4的表達高於對照，胸腺細胞和pbmc的il-4轉錄明顯相關。tx1周後pbmc il-4的表達減少,1月後ifn-γ轉錄下降。結論 mg患者體記憶體在特異性細胞免疫活化和細胞因子網路的失衡，pbmc有些免疫學引數能反映胸腺的免疫學改變；胸腺增生和胸腺瘤的mg發病機制可能不同；tx及其後應用糖皮質類固醇治療是必要的。

分類號：r746．1;r322．5　文獻標識碼：a

文章編號：1000-8861(2000)02-0116-05

specifie cell-mediated immune response in myasthenia gravis

guo hong ,sun hong ,xu xian-hao ,wang hong ,zhang hun ,li bao-lin(department of neurology,bejing hospital,the ministry of health,beijing 100730)

abstract：objective to explore the specific ce11-mediated immune response in the patients with myathenia gravis (mg).methods ifn-γand il-4 secreted by peripheral blood mononuclear cells(pbmc)and thymocytes in mg patients and healthy controls were determined with elisa．ifn-γand il-4 mrna were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(rt-pcr)after cultured with the stimulation of human nocontinic acetlcholine receptor.the ifn-γ and il-4expression were monitored in mg patients with thymectomy(tx)．results the expression of ifn-γby pbmc was significartly elevated on all mg pattents，especlally more higher in the acute stage，the transcription of ifn-γand il-4,il-4 secretion from thymocytes in mg patients with thymic hyperplasia was high．il-4 mrna in thymocytes was well correlated with that in pbmc．il-4 secretion declined one week after tx while ifn-γ mrna decreased one month after tx.conclusions there was an activation of specific cell-mediated immunity and an imbalance of cytokines from th2 and th2 in mg patients．some of the immune parameters in pbmc might reflect the immun alterations in the thymus from mg panents．the immune mechanism of mg patients with hyperplasia is differnet from that thymoma.thymectomy followed by treatment with a-drenocorticosteroid is necessary for mg pattents．

keywords：myathenia gravis;ifn-γ;il-4

　　重症肌無力(myastheniagravis,mg)是乙醯膽鹼受體抗體(achrab)針對神經肌肉接頭交觸後膜上achr進行破壞而引起的1種獲得性自身免疫疾病，曾一度認為體液免疫異常是mg的唯一致病因素，但近年來越來越多的研究表明細胞免疫也參與了mg的發病過程。象其它自身免疫疾病一樣，mg的發源地至今不明，但目前認為胸腺的可能性最大。因為約75%的mg患者伴有胸腺異常，其中85%為胸腺增生，15%為胸腺瘤[1];研究還發現，mg患者增生的胸腺記憶體在大量achr特異應答性t、b細胞，且遠較外周血為多[2];胸腺細胞可表達il-2、il-1、il-6等細胞因子[3,4]提示mg患者胸腺存在免疫學改變。臨床發現胸腺摘除(tx)後，多數患者病情好轉,但tx並非對所有mg患者均有效,有些伴胸腺瘤患者甚至於tx後會加重[5]，還有一部分mg患者胸腺病理正常，mg患者的pbmc是否存在細胞免疫的活化，不同病理表現mg患者的胸腺組織細胞免疫活性是否也有差異，外周血相應的免疫引數是否能夠反映胸腺的免疫學變化，tx後pbmc的細胞活性有否變化，弄清這些問題，不僅有利於對mg發源地的進一步認識，而且有利於治療方案的個體化。根據表達細胞因子的不同，將輔助性t細胞(th)分為th2和th2兩個亞類，ifn-γ主要由th2表達，il-4主要由th2表達。本文檢測了30例mg患者的pbmc、10例行tx的mg患者胸腺和外周血單個核細胞在特異性抗原achr刺激下ifn-γ、il-4mrna的表達情況，同時檢測了細胞培養上清液中2種細胞因子的蛋白表達情況，並與健康對照組進行比較，試圖在分子水平上，從細胞因子角度瞭解mg患者外周血和胸腺細胞的免疫活性情況。

　　 1材料與方法 1.1研究物件所有進入研究的均為北京醫院神經科根據臨床表現、新斯的明試驗、血清achrab測定、肌電圖重複電刺激和單纖維肌電圖檢查確診的mg患者。取pbmc用於檢測者30例，男16例、女14例，年齡13～66(38．2±15．8)歲，病程50d～12(3．1±3．6)年，其中14例為初發3個月或復發1個月以內的患者，根據改良的osserman分型：　a、b、⒑廷ば頭直鷂1、6、16、2和5例。於胸外科行tx的mg患者10例,男6例，女4例，年齡13～57(38．3±15．9)歲，病程50d～(1．35±1.57)年，　a、b、：廷ば頭直鷂0、2、4、3和1例。術前行縱隔ct檢查，報告：胸腺增生4例，胸腺瘤2例,正常萎縮3例,另1例未能確定胸腺瘤或增生。tx後病理證實：2例為胸腺瘤,餘8例均為胸腺增生。1例曾用糖皮質類固醇激素治療，並於術前將激素減量至15mg/d，餘9例均未曾用過免疫治療，10例患者於術後第9d拆線，於第10d進行大劑量糖皮質類固醇激素衝擊治療。

　　 健康對照組：20名外周血取自北京醫院職工、學生或患者家屬，男、女各10名，年齡25～48(35.2±7．4)歲;4例正常胸腺取自先天性心臟病患者行開胸手術者(阜外醫院)，男、女各2例，年齡9～39(24．5±14．3)歲。

　　 1．2實驗方法 1.2．1外周血及胸腺單個核細胞的分離及培養：取肝素靜脈抗凝血10ml，用淋巴細胞分離液提取單個核細胞；取手術摘除之胸腺，生理鹽水沖洗乾淨後，剪碎，篩網過濾，分散成單個細胞，用淋巴細胞分離液提取單個核細胞；行tx的mg患者於tx當日、術後1周、2周及術後1個月分別取靜脈抗凝血10ml，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，並於當天進行臨床評分。

　　 粗提的人腓腸肌achr[5],採用“固相抗原法”純化[7]。將單個核細胞加入到結合有achr的96孔細胞培養板中，每孔3×105個細胞，在37℃，5％co2孵育6h後，收集部分細胞，其餘繼續培養，48h後離心，收集上清液，凍於-80℃備用。1．2．2rt―pcr結合狹縫印跡雜交檢測ifn-γ和il-4的mrna表達：一步法提取細胞總rna。於每份rna中加鳥型逆轉錄酶(amv)15u,置42℃水浴1h，得到逆轉錄產物cdna，進行pcr擴增。在潔淨的eppendorf管中依次加入mgcl2(25mmol／l)、4種dntp混合物(2．5mmol／l)、上下游引物(15μmol／l)、cdna5μl,總體積25μl。95％℃預變性5min，加入1μtaqdna聚合酶，在熱迴圈儀(ptc-51b，軍事醫學科學院)上進行pcr反應，條件為：94℃變性30s，72℃延伸45s，退火溫度分別為：ifn-γ54.5℃，il-458℃，β-actin65℃，均為30s。迴圈35次,72℃延伸10min。反應產物於1．5%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。

　　 ifn-γ、il-4和β-actin的pcr引物寡核苷酸序列的5'和3’端依次為cagctctgcatcgttttgggg和actgggatactcttcgacct;cccctctgttcttcctgcta和ctctggttggcttccttca；gtggggcgccccaggcacca和ctccttaatgtcacgcacgatttc； 將pcr產物95℃變性後經狹縫加樣器點樣於硝酸纖維素膜。取出膜，預雜交後,加dig標記的探針(boehringermannheim)雜交，充分洗膜，封閉，加抗dig抗體反應30min，加入新配製的底物工作液，避光反應1h，用tris-edta終止反應。結果用鐳射密度掃描器檢測。

　　 1．2．3結果計算：以“相對單位”表示pcr擴增產物的量。β-actin作為內對照。計算公式如下： 1.3統計學處理使用excel7．o統計軟體，用t檢驗，相關回歸等處理有關資料。　2結果 2．1mg患者pbmc經acmc刺激後ifn-γmrna轉錄和表達見表1。

　　 表1mg患者pbmc中ifn-γmrna轉錄和表達 tab1expressionandtranscriptionofifn-γinpbmc 0．01)，其中10例ifn-γ值高於正常均值±2s(30．2±19．8)，健康對照組只有1例高於此上限。

　　 2．2mg患者pbmc經acmc經achr激後il-4mrna轉錄和表達見表2。

　　 表2mg患者pbmc中il-4mrna轉錄和表達 tab2expressionandtranscriptionofil―4inpbmc *p＜0.05，**p＜0.01，comparedwithcontrol pdmc與achr共同孵育後，經rt―pcr結合狹縫印跡雜交，檢測30例mg患者ipn-γmrna轉錄雖高於對照組，但無顯著意義(p＝0．43)。而14例急性期mg患者的ifn-γmran轉錄高於對照組(p＜0．01)。患者組ifn-γ表達量高於健康對照組(p＜0．05),14例急性mg患者更明顯(p＜ 表3胸腺細胞和pbmc的ifn-γmrna轉錄和表達 *p＜0.05，**p＜0．01，comparedwithcontrol pbmc的il-4mrna轉錄和表達，無論在30例mg患者還是其中14例急性期患者，與對照組比較均無顯著差異(p＞0．05)。

　　 2．3胸腺細胞和pbmc的ifn―γmrna轉錄和表達情況見表3。

　　 10例mg患者胸腺單個核細胞經achr刺激 tab3expressionandtranscriptionofifn-γinthymocytesandpbmc *p＜0．05，comparedwithcontrol 後，ifn-γmrna轉錄及表達雖高於健康對照，但無統計學差異(p＞0．05)，進一步分析其中8例病理報告為增生者,發現胸腺和外周血的單個核細胞ifn-γmrna轉錄均高於健康對照(p＜0．05)；同時發現外周血細胞培養上清液中ifn-γ的表達也表4胸腺細胞和pbmc的il-4mrna轉錄和表達情況高於健康對照(p＜0.05)。而另2例病理診斷為“胸腺瘤”的mg患者，其胸腺細胞ifn-γmrna轉錄和表達與對照組比較無統計學意義。

　　 2．4肭腺細胞和pbmc的il-4mrna轉錄和表達情況見表4。

　　 tab4expressionandtranscriptionofil-4inthymocvtesandpbmc *p＜0．05,comparedwithcontrol 10例患者胸腺細胞il-4mrna轉錄及表達均明顯高於健康對照組(p＜0.05)。而pbmc則無明顯區別。進一步分析發現：胸腺增生者胸腺細胞il-4mrna轉錄明顯(p＜0．01)高於健康對照,其表達也明顯高於健康對照(p＜0．05)，而胸腺瘤者胸腺細胞的il-4mrna轉錄及表達與健康對照無明顯區別(p＞0．05)。

　　 2．5胸腺和周圍血相關性 2．5.1ifn-γ：8例胸腺增生者胸腺和外周血單個核細胞ifn-γmrna的轉錄和表達相關不密切(γ分別為0．49和0．46，p＞0．05)，無統計學意義。

　　 2．5．2il―4：8例胸腺增生者胸腺和外周血單個核細胞il―4mrna轉錄明顯相關(γ＝0.84，pc＜0．01)。而表達量的相關性不密切(γ＝0．21．p＞0．05)。

　　 2．6動態觀察8例胸腺增生者的外周血細胞ifn-γ和il-4的轉錄及表達情況見表5。

　　 表5動態隨訪tx患者臨床評分和pbmc細胞因子的mrna轉錄與表達 tab5thedynamictrendsofthetranscriptionandexpressionofifn-γandil-4 *p＜0.05，**p＜0.001,comparedwiththatdayoontx 動態檢測兩種細胞因子的mrna轉錄和表達情況，發現pbmc的ifn-γmrna轉錄在術後1月即病情明顯好轉時減少(p＜0．05),而ifn-γ的表達雖然有所下降,但無明顯意義。il―4mrna轉錄在術後1周和1個月時都出現下降，但與術前比較無明顯差異，而在術後第1周發現il-4的表達出現一過性減少，且與術前比較有臨床意義(p＜0．05)。

　　 3討論 3．1mg患者achr特異性th2的活化ifn-γ主要由有絲分裂原或特異性抗原刺啟用化的cd4-th2細胞表達，是細胞活化早期產生的1種具有多種免疫調節因子，可以上調淋巴細胞或組織細胞表面的組織相容白細胞抗原±囁乖表達，啟用巨噬細胞且參與b細胞免疫應答。ifn-γ與il-2、tnf-a有協調作用,從而增強t、b細胞的活化、增殖，增強細胞與體液免疫應答。

　　 本組30例mg患者，尤其是14例急性期患者的pbmc經achr刺激後，ifn-γ表達高於對照組,且與其相應mrna轉錄一致；胸腺增生者pbmc的ifn-γmrna轉錄和表達亦高於健康對照組,且發現隨著mg患者病情的好轉，其pbmc的ifn-γmrna轉錄明顯減少，提示mg患者有achr特異性th2細胞活化增高，ifn-γ可能作為效應因子參與了mg的發病過程。

　　 3．2mg患者achr特異性th2變化il-4作為th2細胞的自身活化因子,可以促進b細胞的增殖、產生igg，被認為是介導體液免疫應答的主要因子之一。本組mg患者pbmc的il-4表達和mrna轉錄均不高，但發現胸腺細胞il-4mrna轉錄和表達均高於健康對照組，尤以胸腺增生者為著，且與其pbmc的il-4mrna轉錄明顯相關；動態觀察胸腺增生者的pbmc，其il-4mrna轉錄在病情好轉時出現下降，但與術前比較無明顯差異，而在術後第1周發現il-4表達出現一過性減少．且與術前比較有統計意義，證明在mg患者增生的胸腺中存在有th2細胞的活化。

　　 3．3不同胸腺病理者,其臨床表現、轉歸和免疫學變化不同：胸腺是t細胞發育、成熟的場所，在mg發病機制中的重要作用早巳為人們所認識，而且tx現被認為mg的首選治療方案[8]，但同時發現不同胸腺病理表現的患者其臨床表現和實驗室檢查均有許多差異，本文結果也支援這一點。

　　 本文行tx的10例mg患者中8例為胸腺增生者，其抗原特異性單個核細胞ifn-γ和il-4的mrna轉錄和ifn-γ表達均明顯高於健康對照，其臨床療效較好。而2例胸腺瘤患者這2種細胞因子mrna轉錄均很低。胸腺摘除術後，其臨床療效差，需輔以其它免疫治療。

　　 3．4mg的發病機制有人推測伴有胸腺瘤的mg與伴胸腺增生的mg發病機制可能不同[7,8]。不僅2者在胸腺內的細胞組成、形態、發病年齡、性別不同，病情轉歸亦不同[9]。許多胸腺瘤患者於tx後病情加重[6,10]，而且有些胸腺瘤患者於tx前未表現有mg症狀，僅是因非mg原因檢查時發現胸腺瘤，於tx後出現mg，有人推測胸腺瘤可產生某些抑制性因子[11,12]，抑制了自身免疫現象的發生，而tx後這種抑制因子消失，故可誘發mg或加重原有的mg。尚有人報道胸腺瘤內有achr特異性t細胞，但未見b細胞[13]。本實驗中2例胸腺瘤患者achr特異性單個核細胞ifn-γ和il-4的mrna轉錄均很低，可能與胸腺瘤內免疫抑制因素的存在有關，也可能與病例數較少有關。

　　 而胸腺增生的mg患者胸腺內achr特異性單個核細胞反映其活躍程度的ifn-γ、il-4mrna轉錄增高，動態觀察發現tx後1周，pbmc的il-4表達出現下降，伴隨著臨床症狀的好轉，可能表明增生的胸腺細胞中輔助因素占主導地位。　3．5胸腺和周圍血免疫學異常的相關性胸腺是免疫中心器官，mg患者主要病理和免疫學異常可能在胸腺。一般文獻報道mg患者的免疫學異常是用周圍血檢測來了解患者的免疫學狀態。但這是否可信，於是我們進行了胸腺和周圍血有關免疫學異常的對比檢測，以瞭解此兩者間相關性。

　　 本組8例胸腺增生者的胸腺和周圍血中的細胞因子間的關係：il-4mrna轉錄明顯相關(p＜0．05)；ifn-γmrna轉錄及其表達基本相關，但未達統計學上有意義的程度；但il-4表達無相關性。可能有些引數相關密切，有一些相關不密切，這方面有待進一步深入研究。

　　 3.6th2和th2的失衡ipn-γ是由th2細胞表達產生，il-4由tb2細胞產生。il-4是b細胞生長刺激因子，可以刺激b細胞增殖、活化,轉化成漿細胞並表達抗體，從而增強體液免疫。在人類ifn-γ可以增強il-4的這種功能。本文結果提示：mg患者增生的胸腺內th2細胞和th2細胞的免疫活性均增強，且以tn2為主，il-4的增高在胸腺細胞和外周血細胞中是有一定的相關性的；而pbmc則以th2增高為主，mg患者體記憶體在著細胞因子網路的失衡。

　　 3．7tx後給予患者糖皮質類固醇激素衝擊是必要的動態隨訪行8例胸腺增生者，於術後第9d拆線，第10d開始給子糖皮質類固醇激素衝擊治療。以往經驗發現在mg患者由於胸腺的摘除，achrab的驟降，患者的臨床症狀會在數天內好轉，但是由於在二級淋巴器官仍存在有長命t淋巴細胞，故患者旋即出現症狀加重，所以臨床多予糖皮質類固醇衝擊治療，而患者在衝擊的1～10d可能出現加重，本組8例患者在術後1周的臨床評分較術前減輕(p＜0．05)，但在2周時有部分患者加重，而術後1個月患者的臨床評分明顯好於治療前(p＜0．001)。動態檢測2種細胞因子的mrna轉錄和表達情況，發現pbmc的ipn-γmrna轉錄在術後1月即病情明顯好轉時減少(p＜0．05)，而ipn-γ的表達也有所下降。il-4mrna轉錄在術後1周和1個月時都出現下降，但與術前比較無明顯差異。而在術後第1周發現il-4的表達出現一過性減少，且與術前比較有臨床意義(p<>

　　 總之，本文從一個角度證明了mg患者外周血和胸腺存在免疫學異常，提示胸腺摘除及輔助以糖皮質類固醇衝擊對治療mg是必要的；外周血免疫引數可基本反映胸腺細胞的免疫活躍程度，可為臨床治療的個體化提供線索，但這方面有待累積更多資料。

基金專案：衛生部課題基金資助專案(96-3-101)

作者簡介：國 紅(1962-)．女，山東壽光縣人，副主任醫師，大學，主要從事神經免疫的研究。參考文獻：

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收稿日期：2000-01-04